|
（１）完全長のHCVゲノムクローニング
HCVはフラビウイルス科のへパシウイルス属に分類される。フラビウイルスの仲間には日本脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、デングウイルスなどがあり、い ずれもプラス鎖の10-11kb長の一本鎖RNAをゲノムに持つ。HCVの場合は、1989年に米国カイロン社の研究グループによりHCVゲノムの一部が 発見されて以来、世界中のグループが完全長のゲノムのクローニングを目指した。同じ一本鎖RNAウイルスのポリオウイルスでは感染性cDNAクローンが樹 立されており、ウイルスゲノムのcDNAあるいはcDNAを鋳型として合成したRNAを細胞に導入することにより、感染性ウイルスを産生することが可能に なっていた。このようなリバースジェネテックスの技術はポリオウイルス研究を飛躍的に進歩させたことから、HCVでも同様な試みがなされてきた。この過程 で第一に重要な発見はHCVの完全長のウイルスゲノムの分離である。従来のHCVのゲノムの３’末端はポリUまたはポリAで終わっていると考えられていた が、実は98塩基長の３’x領域が存在することが1995年Tanakaらによって報告された(Tanaka et al., 1995)。これによりHCVゲノムの完全長が明らかになった。
（２） HCVゲノムの構造と機能
HCVは約9600塩基長からなるプラス鎖の一本鎖RNAをゲノムとしている(Choo et al., 1989)。このRNAにコードされる約3000アミノ酸からなる一本のポリプロテインは、宿主及びウイルスのプロテアーゼによって切断を受け、ウイルス 粒子を形成する構造蛋白質 (Core、E1、E2) とウイルス粒子に含まれない非構造 (NS) 蛋白質 (NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B) が産生される(図 1)。さらに、構造蛋白質のC末端側にはp7と呼ばれる小さな分子が存在するが、p7がウイルス粒子に含まれるかどうかは不明である。 一般的に、ヘパシウイルスは大きく６種類の遺伝子型に分けられ、それぞれは塩基で31-34％、アミノ酸レベルで30％程度の違いが認められている。他 のRNAウイルスと同様にHCVでも、そのゲノムの特徴として多様性が上げられ、「クアシピーシス」と呼ばれている(Martell et al., 1992)。HCVで「クアシピーシス」が多いのは、NS5B遺伝子がコードするRNA依存性RNAポリメラーゼのエラー率が高いことによるものと考えら れている。HCVの「クアシピーシス」はウイルス持続感染に貢献しているものと考えられている。実際、慢性肝炎の患者では自然治癒した患者に比べて「クア シピーシス」が大きいことが報告されている(Pawlotsky et al., 2006)。変異率はそのゲノムの領域によって大きく異なっており(Martell et al., 1992, Pawlotsky et al., 2006)、エンベロープ領域は最も変異率が高く、一方、ゲノムの末端の5’, 3’非翻訳領域(UTR)は最も変異率が低い。特にE2のN末端の27塩基長の超可変領域１に変異が集中している(Hijikata et al., 1991, Weiner et al., 1991, Kato et al., 1992)。
（３）HCVゲノムの非翻訳領域の構造と機能
HCVゲノムのRNA構造と機能に関して最も重要なのは両末端の非翻訳領域である。HCVの5’UTRは約341塩基からなり、その塩基配列はHCV株 間でよく保存されている。この領域は多くのステムループ構造を持った4つの主なドメイン (domain I-IV) 及びpseudoknotと呼ばれる特徴的な二次構造からなり、5’末端キャップ構造非依存的な翻訳に関わるinternal ribosomal entry site (IRES) を有する(Bukh et al., 1992, Brown et al., 1992, Tsukiyama-Kohara et al., 1992, Wang et al., 1993, Honda et al., 1996,)。また、5’UTRはゲノム複製にも重要であることが報告されている。特に、IRESの上流の遺伝子配列はウイルス複製に、IRES領域の配 列は複製の効率に関与し、特にIRESのステムループIIが複製に必須ということが判明している（Friebe et al., 2001）。最近、肝臓特異的マイクロRNA (miR-122) が5’UTRに結合し、HCV RNA複製調節に関与することが報告された(Jopling et al., 2005)。 3’UTRは短い可変領域、約80塩基長のpoly(U/UC) stretch、及び98塩基長の3’X領域から構成され、その長さは200-235塩基とウイルス株により大きく異なっている(Tanaka et al., 1995, Kolykhalov et al., 1997, Ito et al., 1999)。レプリコンシステムを用いた実験からpoly(U/UC) stretch及び3’X領域がゲノム複製に必須であることが示されている(Friebe et al., 2002, Yi et al., 2003)。
HCVはフラビウイルス科のへパシウイルス属に分類される。フラビウイルスの仲間には日本脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、デングウイルスなどがあり、い ずれもプラス鎖の10-11kb長の一本鎖RNAをゲノムに持つ。HCVの場合は、1989年に米国カイロン社の研究グループによりHCVゲノムの一部が 発見されて以来、世界中のグループが完全長のゲノムのクローニングを目指した。同じ一本鎖RNAウイルスのポリオウイルスでは感染性cDNAクローンが樹 立されており、ウイルスゲノムのcDNAあるいはcDNAを鋳型として合成したRNAを細胞に導入することにより、感染性ウイルスを産生することが可能に なっていた。このようなリバースジェネテックスの技術はポリオウイルス研究を飛躍的に進歩させたことから、HCVでも同様な試みがなされてきた。この過程 で第一に重要な発見はHCVの完全長のウイルスゲノムの分離である。従来のHCVのゲノムの３’末端はポリUまたはポリAで終わっていると考えられていた が、実は98塩基長の３’x領域が存在することが1995年Tanakaらによって報告された(Tanaka et al., 1995)。これによりHCVゲノムの完全長が明らかになった。
（２） HCVゲノムの構造と機能
HCVは約9600塩基長からなるプラス鎖の一本鎖RNAをゲノムとしている(Choo et al., 1989)。このRNAにコードされる約3000アミノ酸からなる一本のポリプロテインは、宿主及びウイルスのプロテアーゼによって切断を受け、ウイルス 粒子を形成する構造蛋白質 (Core、E1、E2) とウイルス粒子に含まれない非構造 (NS) 蛋白質 (NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B) が産生される(図 1)。さらに、構造蛋白質のC末端側にはp7と呼ばれる小さな分子が存在するが、p7がウイルス粒子に含まれるかどうかは不明である。 一般的に、ヘパシウイルスは大きく６種類の遺伝子型に分けられ、それぞれは塩基で31-34％、アミノ酸レベルで30％程度の違いが認められている。他 のRNAウイルスと同様にHCVでも、そのゲノムの特徴として多様性が上げられ、「クアシピーシス」と呼ばれている(Martell et al., 1992)。HCVで「クアシピーシス」が多いのは、NS5B遺伝子がコードするRNA依存性RNAポリメラーゼのエラー率が高いことによるものと考えら れている。HCVの「クアシピーシス」はウイルス持続感染に貢献しているものと考えられている。実際、慢性肝炎の患者では自然治癒した患者に比べて「クア シピーシス」が大きいことが報告されている(Pawlotsky et al., 2006)。変異率はそのゲノムの領域によって大きく異なっており(Martell et al., 1992, Pawlotsky et al., 2006)、エンベロープ領域は最も変異率が高く、一方、ゲノムの末端の5’, 3’非翻訳領域(UTR)は最も変異率が低い。特にE2のN末端の27塩基長の超可変領域１に変異が集中している(Hijikata et al., 1991, Weiner et al., 1991, Kato et al., 1992)。
（３）HCVゲノムの非翻訳領域の構造と機能
HCVゲノムのRNA構造と機能に関して最も重要なのは両末端の非翻訳領域である。HCVの5’UTRは約341塩基からなり、その塩基配列はHCV株 間でよく保存されている。この領域は多くのステムループ構造を持った4つの主なドメイン (domain I-IV) 及びpseudoknotと呼ばれる特徴的な二次構造からなり、5’末端キャップ構造非依存的な翻訳に関わるinternal ribosomal entry site (IRES) を有する(Bukh et al., 1992, Brown et al., 1992, Tsukiyama-Kohara et al., 1992, Wang et al., 1993, Honda et al., 1996,)。また、5’UTRはゲノム複製にも重要であることが報告されている。特に、IRESの上流の遺伝子配列はウイルス複製に、IRES領域の配 列は複製の効率に関与し、特にIRESのステムループIIが複製に必須ということが判明している（Friebe et al., 2001）。最近、肝臓特異的マイクロRNA (miR-122) が5’UTRに結合し、HCV RNA複製調節に関与することが報告された(Jopling et al., 2005)。 3’UTRは短い可変領域、約80塩基長のpoly(U/UC) stretch、及び98塩基長の3’X領域から構成され、その長さは200-235塩基とウイルス株により大きく異なっている(Tanaka et al., 1995, Kolykhalov et al., 1997, Ito et al., 1999)。レプリコンシステムを用いた実験からpoly(U/UC) stretch及び3’X領域がゲノム複製に必須であることが示されている(Friebe et al., 2002, Yi et al., 2003)。