真菌および真菌症の検査法

真菌症の確定診断は難しく, 臨床現場においては真菌症疑いにとどまってしまうことも少なくない。真菌症の診断基準の1つとして頻用される『改訂European Organization for Research and Treatment of Cancer and the Mycoses Study Group（EORTC/MSG）』criteriaでは, 確定診断に必要な検査項目として, 罹患臓器（臨床検体）から真菌が分離されること, および病理組織学的に特徴的な真菌の所見を確認すること, の2点がまず挙げられている^1）。また, 真菌種によっては血清学的診断（クリプトコックス属のグルクロノキシロマンナン抗原検査: 後述）が確定診断の根拠として用いられることや, 病理組織学的に真菌が確認された場合に, パラフィンブロックから作製された切片の遺伝子検査を行うことで菌種同定・確定診断となることも併せて規定されている。これらの確定診断の根拠を基に考えると, 真菌症診断において重要な項目として, A）適切な検体を（罹患臓器から確実に）, B）適切な時期に（可能な限り抗真菌薬投与前に）, C）無菌的に（環境真菌の混入を最大限防ぐ形で）採取し検査に供すること, の3点が考えられる。真菌症診断に必要な検査のうち, 分離真菌の同定検査や血清学的診断の一部は検査会社などで対応可能なものもあるが, すべての検査にはまだ対応できていないのが現状である。

国立感染症研究所真菌部（以下, 真菌部）では前述の背景を受け, ①分離菌株の遺伝子検査・薬剤感受性試験, ②臨床検体の培養・遺伝子検査, ③パラフィン切片からの遺伝子検査, ④地域流行型真菌症疑い症例における抗原・抗体検査, などの真菌検査業務を, 医療機関からの依頼検査または行政検査の形で実施している^2）。

分離真菌を臨床検体から得ることは, 同定・薬剤感受性試験を実施することが可能となるため臨床的に大きな意義がある。従来, 分離された菌株の同定には形態学的・生化学的手法が広く用いられていたが, 近年の遺伝学的同定法の普及にともない, 従来の手法では同定が困難な菌種, 他菌種に誤同定される菌種が存在することが明らかとなってきているため, 現在では分離菌株の同定には遺伝学的同定法を用いることが一般的になっている。菌株の遺伝子検査においては, rRNA遺伝子領域〔internal transcribed spacer（ITS）領域およびD1/D2領域〕の塩基配列を解析し, データベースと照合して同定することが一般的である。rRNA遺伝子領域の解析のみでの菌種同定が困難な場合は, その他の領域〔例: クリプトコックス属やトリコスポロン属の場合はintergenic spacer（IGS）領域, アスペルギルス属の場合はβ-tubulin遺伝子やcalmodulin遺伝子など〕の塩基配列解析も行い, rRNA遺伝子領域の結果と合わせて総合的に同定を行うことが必要となる。

臨床検体の検査に当たっては, 臨床現場で採集された生検検体・手術検体のほか, 気管支肺胞洗浄液, 血液, 胸水・腹水, 脳脊髄液など, 様々な検体を対象とする。真菌部では, これらの検体を培地に接種し, 一定期間培養を行い, コロニー生育の確認・純培養を行う培養検査と, 各種臨床検体から抽出したDNAをサンプルとして実施する遺伝子検査の2種類を主に実施している。臨床検体からの遺伝子検査においては, 菌株の遺伝子検査同様, rRNA遺伝子領域および疑われる真菌種ごとに設定した遺伝子領域の塩基配列解析を行い, データベースと照合して原因菌種の同定検査を行う。また, 臨床検体からの真菌分離培養に際し, 海外渡航歴・居住歴から地域流行型真菌症（コクシジオイデス症, ヒストプラスマ症など）が疑われる場合は, 検体の取り扱いに特に注意を要する。これらの真菌はバイオセーフティレベル（BSL）3に位置付けられ, 健常人においても真菌感染症を発症する可能性があること, また特にコクシジオイデス属の場合は, 寒天培地に発育したコロニーから胞子が飛散することによる検査室内感染のリスクが高いことから, 一般の施設においてこれらの真菌を扱うことは極めて危険である。臨床情報から地域流行型真菌症が疑われる場合, 疑いの時点で真菌部（https://www.niid.go.jp/niid/ja/fungi-kensa.html）または千葉大学真菌医学研究センターに連絡し, 臨床検体の処理方法等に関して事前に相談しておくことが望ましい。

臨床検体の培養・遺伝子検査から真菌症を支持する結果が得られなかった場合でも, 病理組織学的に真菌に特徴的な所見が認められた場合には, パラフィンブロックから作製した切片を対象とした遺伝子検査も診断の1つの選択肢となりうる。パラフィン切片からDNAを抽出し, 真菌由来の塩基配列が検出されるか解析することにより, 原因真菌に関する情報を得ることが可能なケースも存在する。しかしながら, パラフィン切片からの遺伝子検査で真菌の同定が可能かどうかに関しては, 組織中に存在する真菌量に依存するところが大きい。病理組織学的に認められる真菌量が少ない場合は, ヒト由来の塩基配列しか検出されない, あるいは環境真菌の混入を検出してしまう可能性が高まるため, 注意を要する。病理組織学的検査でどの程度の真菌が認められた場合にはパラフィン切片の遺伝子検査で原因真菌が同定可能であるか, という定量的な判断は今後の課題である。

培養・遺伝子検査以外の診断法としては, 血清学的診断が挙げられる。臨床現場で使用可能な検査のうち, 確定診断になる検査の1つとして, 前述のクリプトコックス属のグルクロノキシロマンナン抗原検査が挙げられる。本検査は, 血清のほか脳脊髄液を検体とした検査が実施可能であり, 検査陽性は確定診断となる重要な所見である。その他, 補助診断ではあるが信頼度が比較的高いものとして, 血液悪性疾患患者等におけるアスペルギルス属ガラクトマンナン抗原検査, 真菌全般を対象としたβ-D-グルカン検査などが臨床上頻用されるが, 偽陽性・偽陰性例の存在が報告されており, 得られた結果は臨床情報と合わせて解釈することが重要である^3,4）。血清学的診断の範囲で真菌部で実施する検査としては, 地域流行型真菌症に対する抗原・抗体検査が挙げられる。具体的には, コクシジオイデス症疑い患者の抗体検査（血清）, ヒストプラスマ症疑い患者の抗原検査（尿）の2種類である。いずれも補助診断の位置付けではあるが, 海外渡航歴・居住歴から上記真菌症を疑う患者において, 臨床検体の検査と合わせて実施することで診断に近づくことが可能となる。

真菌症の診断は難しく, 新規診断法の開発研究が今後の大きな課題である。前記診断法のほかに, 真菌部ではイムノクロマト法に基づく新規診断法の開発研究や, 研究ベースでの次世代シーケンスを用いた遺伝子検査法なども進めている。より正確な真菌症診断を目指し, これらの研究を進めることが喫緊の課題であると考えられる。

参考文献