散発２事例からのコクサッキーウイルスA群21型の検出―東京都

東京都健康安全研究センターでは、感染症発生動向調査事業の一つとして、都内の内科病原体定点医療機関（15定点）から提供されるインフルエンザ様症状を示す患者検体の検査を行っている。2013年第35～36週（８月26日～９月８日）に採取された２検体から、国内では非常に検出の稀なコクサッキーウイルスA群21型（以下CA21と略）が検出されたので報告する。

検体は、第35週および第36週に23区内の異なる区から咽頭ぬぐい液が各１検体ずつ搬入された。患者（39歳、17歳）は、いずれも発熱（38.3℃、39℃）、筋関節痛、上気道炎等の風邪様症状を呈していた。患者の発症前行動は、約２週間前にフィリピンへの渡航歴がある例と国内に滞在していた例で、両者に共通性は無かった。また、患者の発症時期から推定すると、両例とも国内における感染が強く疑われた。

病原体検索は、エンテロウイルスの遺伝子検査として、ノンコード領域に設計されたスクリーニング検査用プライマーを用いてPCRを行い、増幅産物の配列をNCBIのBlastで相同性検索した結果、CA21の配列に最も近いことが明らかとなった。このためエンテロウイルスの遺伝子型別として有用なVP1領域に設定されたCODEHOP PCR法¹⁾プライマーを用いてVP1領域を増幅し、得られた315bpの塩基配列について相同性検索を行ったところ、CA21ウイルス（JN169053.1）と98%の相同性で一致した。また、エンテロウイルスC種を中心としたVP1遺伝子を用いた遺伝子系統樹解析の結果では、検出された2例ともCA21のクラスターに入ることが確認された （図１）。

一方、A549細胞を用いたウイルス分離試験においても、本事例株はエンテロウイルスに特徴的なCPE（細胞変性効果）を示したが、既存のエンテロウイルスプール血清を用いた中和試験では該当する型が認められなかった。国立感染症研究所ウイルス第二部第二室（エンテロウイルス室）より分与されたエンテロウイルスC種に分類された単味抗血清数種を用いて中和反応を試みたところ、抗CA21血清（20単位で使用）で観察2日までに中和された株と、観察2日目までは抗CA21および抗CA24血清（20単位で使用）で発育阻止を起こしたものの観察４日目に抗CA21のみの中和を確認した株が認められたことから、これらをCA21株と同定した。

CA21ウイルスの国内の検出報告は少なく、特に臨床材料からの報告は1986年に埼玉県の刑務所施設での発生例以来27年ぶりとなる。海外では2006～2010年に中国で行われた調査で患者の26.2％からCA21が検出されており²⁾、フィリピン等でもウイルスの検出報告がある³⁾。また、環境材料（下水検体）からは2010年、2011年に福岡で検出が報告されていることから、今後、国内での発生が危惧されるウイルスの一つといえる。都内では、本例以降、病原体定点検体からCA21は検出されていないため、ウイルスの伝播および拡散は発生しなかったことが推察される。しかし、都内の異なった地域での複数例の感染は、今後のエンテロウイルス発生動向を調査する上で留意する点となった。

2013年、仙台市における手足口病の定点当たりの患者報告数は第25週から増加し始め、第34週でピークに達した後減少した。ピーク時の報告数は定点当たり6.46人で、2012年（6.12人）とほぼ同じ小規模の流行となった。

ウイルス分離・同定は、病原体定点で採取された咽頭ぬぐい液をRD-A細胞に接種後37℃１週間培養し３代目まで継代した。細胞培養にてCPEが認められた検体については、培養上清を精製後、国立感染症研究所から分与された抗血清で中和試験を試みた。中和試験により血清型を決定できなかった分離株については、塩基配列の解析（VP1およびVP4領域）により決定した。また、検体(咽頭ぬぐい液)から市販のキットを用いてRNAを抽出し、CODEHOP PCR法^１）によりVP1領域の遺伝子を増幅した。増幅産物を精製後、ダイレクトシークエンス法により塩基配列を決定し、血清型の同定を行った。

手足口病患者の検体（咽頭ぬぐい液）は、非流行期の2012年12月～2013年１月にかけて３検体が搬入され、細胞でのCPEは観察されなかったが、遺伝子検査によりコクサッキーウイルスA6（CVA6）遺伝子が検出された（表１）。その後、流行開始とともに６月中旬から検体が搬入され始め、10月までに16検体が搬入された。このうち11検体で細胞培養にてCPEが認められ、４検体からの分離株は中和試験によりCVA6と同定された。残り７検体からの分離株も遺伝子解析によりCVA6が６株、CVA2が１株と同定された。一方、遺伝子検査では16検体すべてにおいてCODEHOP PCR法による増幅産物が確認され、遺伝子解析の結果、CVA6遺伝子が14検体から、ライノウイルスが３検体から、CVA2が１検体から検出された。このうち２検体からはCVA6遺伝子とライノウイルス遺伝子が同時に検出された（CODEHOP PCR法による増幅産物はエンテロウイルスが376bpであるのに対し、ライノウイルスは330bpで、混合感染の場合、２本のバンドが検出された）。

検出されたCVA6のVP1領域の系統樹解析の結果、増本らが報告^2）した2011-Japan-B のクラスターに属する遺伝子が4検体から検出されたが、残り10検体から検出されたCVA6遺伝子は、清田ら3)が報告した2013-Kumamotoと同一クラスターに分類された。また、２名のヘルパンギーナ患者検体から検出されたCVA6の遺伝子もこのクラスターに分類された（図）。

2011年に国内でCVA6による手足口病が流行した際、仙台市内で検出されたCVA6は、遺伝子解析の結果、５検体すべて2011-Japan-A のクラスターに属していた。新しいクラスターに属するCVA6は、2012年８月にヘルパンギーナと診断された検体から検出されたのが最初で、2012年12月～2013年１月の非流行期の手足口病の検体から検出された遺伝子もこのクラスターに属していた。また、清田ら^3）が報告した2013-Kumamotoと同一クラスターに分類されたことから、今シーズンのCVA6は新しいタイプが流行したものと思われる。さらに、2013年７月以降に搬入された多くの検体でRD-A細胞においてCPEが認められ、ウイルス分離が可能であったことから、2011年に流行したCVA6と大きな違いがみられた。今後は、非流行期も含め、手足口病から検出される病原体の動向に注意する必要があると考える。

ＨＨＶ6と複数種のピコルナウイルスが検出された１歳９カ月の男児における急性脳症事例

急性脳炎は「感染症の予防及び感染症の患者に対する医療に関する法律」における全数把握5類感染症である。2007年４月の法改正後、急性脳炎としての届出の対象は炎症所見が明らかでなくとも、同様の症状を呈する脳症も含まれるようになった。2007～2010年に急性脳炎（脳症）の症例983事例を調査した研究において、先行する感染症から検出された病原ウイルス上位３種類はインフルエンザ：263症例、ヒトヘルペスウイルス6（HHV6）：168症例、ロタウイルス：40症例であり、低頻度でRSウイルス（RSV）：17症例、アデノウイルス：７症例、ヒトパレコウイルス（HPeV）：２症例などが検出された。ウイルスの重感染（HHV6/RSV）およびウイルスと細菌の重感染（ロタウイルス/カピロバクター）は合わせて５症例（0.5％）報告されているものの報告数は非常に少ない。また、約４割の症例からは病原体が検出されていない^1）。今回、急性脳症と診断された患児の検体からHHV6、エンテロウイルス68型（EV68）、HPeV1型およびコクサッキーウイルスA6（CA6）が検出された。また、その家族において患児から検出されたウイルスを含む複数種のピコルナウイルスが検出されたので報告する。

患児は１歳９カ月の男児。当初発熱（38.4℃）および活気不良のため、近医（耳鼻咽喉科医院）を受診し、突発性発疹が疑われた。診察中、けいれんが出現したため救急搬送された。救急搬入時、発熱（39.3℃）を伴うけいれん重積状態で、その後も意識障害が遷延したため急性脳症と診断された。咽頭ぬぐい液および糞便検体に対してはロタウイルス、アデノウイルスおよびRSVの簡易検査が実施され、全血に対してはHHV6の検索が民間検査会社に依頼された。また、家族において感冒様症状の発生が認められたため、エンテロウイルス（EV）感染症等も疑い、大阪府立公衆衛生研究所に病原体検索が依頼された。

民間検査会社の検査により、全血から低コピー（3×10²コピー/ｍｌ）のHHV6が検出された。ロタウイルス、アデノウイルスおよびRSVの簡易検査の結果はすべて陰性であった。当所には髄液、血清、咽頭ぬぐい液および糞便が検体として提出された。EVに対する遺伝子解析^2）を実施した結果、咽頭ぬぐい液および糞便検体からEV68が検出された。また、RD-A、Vero E6、FL、LLC-MK2、Caco-2およびHEp-2細胞で病原体分離を試みたところ、糞便検体を接種したRD-A細胞にCPE（細胞変性効果）が観察された。培養上清に対する遺伝子検索の結果、EVは陰性であったが、EVに類似したCPEを示すことがしられるHPeV1型^3）が検出された。そこで、HPeVを標的としたrealtime RT-PCR^4）を実施したところ、咽頭ぬぐい液検体からもHPeV遺伝子が検出された。2013シーズン、大阪府では手足口病およびヘルパンギーナの患者からEV71およびCA6が多数検出されていた。特にCA6は培養細胞よりも哺乳マウスでの分離効率が高いため、糞便検体を哺乳マウスに接種したところ、CA6が分離された。髄液検体からHHV6、HHV7^5）およびHPeVの遺伝子検出を試みたが、いずれも陰性であった。なお、追加で搬入された血清からは、EVおよびHPeVのいずれも検出されなかった。

患児が急性脳症を発症した2013年９月上旬に先行して、母親がその４日前から感冒様症状を呈していた。患児発症の前日から父親にも発熱を伴う感冒様症状が出現し、３歳４カ月の姉も患児と同日から発熱を伴わない感冒様症状を呈していた（図１）。家族全員から咽頭ぬぐい液および糞便検体を採取し、上述の方法で病原体検索を実施した。遺伝子検索の結果、家族内で初発患者と思われる母親の糞便検体からEV68が検出された。また、姉の咽頭ぬぐい液からはライノウイルスおよびHPeV、糞便検体からはエコーウイルス18型（Echo18）およびHPeVが検出された。しかし、父親の検体はすべて陰性であった。家族からの検体に対する培養細胞によるウイルス分離培養結果はすべて陰性であった。なお、家族それぞれから検出されたウイルスと検出方法を表１に示す。

HHV6は主要な脳炎（脳症）の原因ウイルスである。しかし、本症例では血液から検出されたHHV6のDNAコピー数は低く、髄液からは検出されなかった。一方、少数ではあるがEV68、HPeVおよびCA6も脳炎（脳症）患者から検出された報告がNESIDに登録されている。血液からHHV6が検出されているとはいえ、全血からであることから、細胞分画にウイルスが潜伏していた可能性も考えられる。しかし、臨床的には急性脳症の発症に先行して、突発性発疹と診断されていることから、HHV6が原因であった可能性は否定できない。本事例では、複数のピコルナウイルスの感染が確認されており、そのことが病態に関与していた可能性も十分に考えらる。急性脳症の患児に複数のウイルスが重感染する報告は極めて稀である。この報告が可能になったのは、医師による詳細な家族歴の聴取と地方衛生研究所との密な情報交換、培養細胞および哺乳マウスでのウイルス分離培養を実施した成果である。原因病原体が不明であることが多い脳炎（脳症）の原因を検索する際には、地域の感染症流行状況から総合的に検索する対象を絞り込む必要があると考えられた。また、多種の細胞株で病原体の分離培養を試みること、場合によっては哺乳マウスによる分離培養を実施することも病原体検索に効果的であると思われた。