ヒラメ生産県におけるクドア対応

近年、一過性の下痢や嘔吐を主な症状とし、食後おおむね２時間～数時間程度の潜伏時間で、予後が比較的良く、かつ、既知の食中毒起因物質が検出されない有症事例が多発している。疫学的調査から、その主な原因食品としてヒラメの関与が指摘され、原因食品として疑われた事例ヒラメから寄生虫Kudoa septempunctata が高率に検出された。

そこで、2010（平成22）年10月～2011（平成23）年１月の間、大分県内のヒラメ養殖業者の協力のもと、養殖ヒラメにおけるクドア属の寄生状況について、リアルタイムPCR法を用い、必要に応じ、顕微鏡観察により調査を行った。なお、本調査は、厚生労働省からの暫定検査法が発出される以前に実施されたものであるため、暫定検査法とは異なる独自法である。

材料および方法
大分県内の養殖業者（42業者）から提供された出荷前ヒラメ437匹について、大分県農林水産研究指導センター水産研究部（以下「水産研究部」という）で筋肉部分を採材したものを調査材料とした。

筋肉部分をスパーテルで少量（約30mg）を掻き取り、２mlのバイオマッシャー（アシスト社）で破砕し、遠心した沈渣を試料とした。DNA抽出は、QIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN社）の組織からの抽出方法に準じてDNAを抽出し、最終的DNA抽出液を200μlに調整した。

結果および考察
ヒラメ養殖業者42業者の計 437匹のヒラメ検体中、15業者58検体（13.3％）からKudoa 遺伝子が検出された（詳細結果については省略）。養殖業者ごとに検出率に偏りが見られたこと。養殖場は主に陸上養殖で、検出率に地域、海域の差が認められなかったこと。３養殖業者について、生産ロットを変えて、繰り返し検査を試みたが、検出率に再現性が得られなかったこと。以上のことから、養殖ヒラメのクドア属汚染における飼育環境（使用海水や餌等）の要因は低いと考えられた。

また、Kudoa 遺伝子が検出されたサンプルについて、水産研究部において精査した結果、数サンプルで４極のK. lateolabracis 、K. thyrsites が確認された。リアルタイムPCRの特異性に問題があることが判明したため、顕微鏡検査での形態確認が必須と思われる。

対　策
平成23年７月以降、大分県においては、消費者へ安全な食品の提供と大分県ヒラメ養殖業者の健全な発展を目的に、大分県漁業協同組合を中心に「種苗導入段階での検査＝入れない」、「養殖段階での検査＝つくらない」、「出荷段階での検査＝出さない」のスクリーニング体制を構築し、安全確保に努めている。

結　語
スクリーニング体制を構築し、安全確保に心血を注いでいるにもかかわらず、ヒラメが原因食品と推定される有症事例は「０（ゼロ）」にはなっていない。さかのぼり調査の結果から、大分県産ヒラメが原因食品と推定されている事例では、県外産もしくは輸入Ｋ国産ヒラメの関与が疑われる事例も散見された。このことから、漁協現場でのスクリーニング体制にも限界があり、輸入や流通段階での対策の構築が急務と考える。併せて、風評被害を払拭するために、輸入Ｋ国産ヒラメとの鑑別方法の開発が望まれる。

Kudoa septempunctata 特異的リアルタイムPCR

ヒラメの喫食に伴う嘔吐・下痢といった食中毒症状の原因は、新種の粘液胞子虫、Kudoa septempunctata であることが明らかになった1,2) 。このK. septempunctata を検出する目的で、厚生労働省通知（2011年７月11日付、食安監発0711第１号）で「ヒラメからのKudoa septempunctata 検査法（暫定）」という、リアルタイムPCRによる検査法を紹介した。しかし、その後の研究で、K. thyrsites やK. lateolabracis といったヒラメに寄生するクドア属にも交差することが判明し、改良を行ったので紹介する。

クドアを含むミクソゾア門に属する粘液胞子虫類は、1,200種以上も知られており3) 、未知のものも多く存在すると考えられる。K. septempunctata の病原因子が見つかれば、K. septempunctata しか持たない（特異的な）遺伝子をターゲットにPCRを設計できると考えられる。しかしながら、K. septempunctata 特異的遺伝子が分かっていない現時点では、もっとも解析の進んでいるrDNAをターゲットにしたPCRを設計するのが最善の策と考えられる。K. septempunctata の18S rDNAの比較的上流に、特異的と考えられる配列があり（図）、それを基にリアルタイムPCRを設計した。プライマーとプローブの配列は以下の通りである。

Forward primer: AATACATAGCAAATCTCACCATGTAAATG
Reverse primer: TGCTCAGTTATTAGGATTCATCAAATG
Probe: FAM-TGGGAGCATTTATTAGACTCGACCAACTGG-TAMRA

95℃ 10分に続き、95℃ 15秒と60℃ 1分を45サイクルで検出する。この検出系は、「ヒラメからのKudoa septempunctata 検査法（暫定）」とほぼ同じ感度を有している。

ヒラメを含む食事で食中毒が発生しても、ヒラメの残品がない場合が多い。そのような場合、患者の吐物や便からのクドアの検査が求められる。吐物に関しては、遠心してその沈渣に対して、通知法にあるQIAamp DNA Mini Kit（QIAGEN社）を用いて「組織からのプロトコール」に従って抽出すれば、検出可能である。便からのDNA抽出に関しては、QIAamp DNA Stool Mini Kit（同社）という商品があるが、このプロトコールに従って抽出した場合、細菌のDNAは抽出できても、クドアからのDNA抽出はうまくいかない。そこで、便からのクドアDNA抽出には、次のような操作を行っている。便の５％乳剤を作製し、遠心する。その沈渣を再懸濁し、ホモジナイズ後、100μmのフィルターでろ過する。そのろ過物を、30％ Percollに重層し、遠心し、Percollの下にできた沈渣を得る。その沈渣を遠心により洗浄した後、QIAamp DNA Mini Kitを用いて「組織からのプロトコール」に従って抽出している。しかしながら、このような煩雑な作業は、ルーチン業務としては不適切であり、より簡便な抽出方法の確立が求められる。

なお、18S rDNAは、すべての真核生物が保有するハウスキーピング遺伝子であり、その塩基配列は比較的よく保存されている。クドア属間でも、その配列はよく保存されているため、今まで報告されていないクドア属等と交差する可能性も否めないが、現時点では交差反応は認められない。また、よく保存されている18S rDNAではあるが、K. septempunctata　においてもわずかではあるが変異が確認されており、検出できない株も存在する可能性があるが、現時点では見つかっていない。

参考文献
1) Matsukane Y, et al ., Parasitol Res 107: 865-872, 2010
2) Kawai T, et al ., Clin Infect Dis 54: 1046-1052, 2012
3)横山 博, 原生動物学雑誌 37: 1-9, 2004

神戸市環境保健研究所微生物部　飯島義雄

ザルコシスティス総論

ザルコシスティスの寄生虫学
ザルコシスティスは胞子虫類のコクシジウム目に属し、トキソプラズマ、アイメリア等に近縁の寄生性原虫である。宿主域は幅広く、ハ虫類、鳥類、およびヒトを含む哺乳類に感染する。その生活環には終宿主と中間宿主の２つの動物を必要とする（図１）。中間宿主は筋肉中に多数のブラディゾイト（増殖虫体）を内包するザルコシストを形成する、多種類の草食動物が中間宿主となる。一方、終宿主は中間宿主動物の肉（ザルコシスト）を食べることで、消化管に原虫が感染後、有性生殖が行われ最終的にオーシスト排出を行う。イヌ、ネコ科の食肉動物が終宿主となる。ザルコシスティス属としては130種類ほどあるといわれるが、種分類は宿主の違い、ザルコシストの形態的特徴などに基づく場合が多く、必ずしも種特異性は明確ではない。

ヒトのザルコシスティス症
ヒトではザルコシスティスが感染する寄生虫症として２つの病態が知られる。ひとつはヒトが終宿主となる場合の消化管ザルコシスティス症で、食肉摂食後３～６時間で下痢、嘔吐、腹痛等の消化器症状が現れるが、これらは一過性で回復する（１日程度）。原因となるザルコシスティスの種類はSarcocystis hominis （ウシが中間宿主）とS. suihominis （ブタが中間宿主）で、ザルコシストを含む生（なま）、あるいは加熱不十分な牛肉、豚肉の摂取が感染の原因となる。感染後２～３週間程度で糞便中にオーシストの排出が見られる（実際にはオーシストのシスト壁が弱く、壊れて出てくるスポロシストが検出される）。主として食肉文化の多様なヨーロッパに多く見られており、タルタルステーキやレアステーキなど牛肉、豚肉が生（なま）あるいはそれに近い加熱処理で食される習慣が背景にある。もうひとつの筋肉ザルコシスティス症は、ある種の動物（終宿主）が排出したオーシストが水や食物を汚染し、ヒトがそれを経口摂取することで、消化管を経て筋肉内にて増殖しザルコシストが形成される。主として発熱と筋肉痛の症状があらわれるが数週間程度で寛解する。ほとんどの場合、無症状に経過する。これまで100例ほどの報告があったが、2011年にマレー半島への旅行者32人に好酸球性筋炎を主徴とする急性筋肉ザルコシスティス症が集団発生している。

診断、治療と予防
消化管ザルコシスティス症が疑われる場合は、顕微鏡的に糞便よりスポロシストを検出すること、筋肉ザルコシスティス症の場合は、筋肉生検でHE染色やPAS染色によりザルコシストを検出することが診断の基本となる。免疫学的診断法もあるが一般的ではない。本症は自然寛解するので、２つの病態ともに特に化学療法による治療法は確立していない。食肉からの感染を防ぐには、加熱調理、冷凍処理が有効である。豚肉の場合、70℃で15分あるいは100℃で５分間の加熱、また、－４℃で48時間あるいは－20℃で24時間の凍結で感染性が消失する。家畜の感染を防ぐには、与える飼料、水または畜舎などのスポロシスト汚染を防ぐことが重要であり、ヒトの場合も同様で、水を煮沸する、食品は清浄な水で洗浄することが予防のポイントである。

動物のザルコシスティス感染
家畜であるウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマはザルコシスティスの中間宿主動物であり、複数の種類が感染する（表１）。不顕性の場合が多いが、ウシのS. cruｚi 、ヒツジのS. tenella の病原性は強い。ウシのS. cruzi 感染率は多くの国で90％以上と高いが、原虫感染量は明らかではない。国内ではウシのS. cruzi 感染率は輸入個体でおよそ50％、国産牛では品種によるが30～90％、また肥育牛でも30～50％（本号14ページ参照）の感染が見られている。S. hominis は1999年に初めての感染例が国産牛で報告されたが、国内感染率の調査はない。ウマではS. fayeri 、S. bertrami 、S. equicanis の３種類が筋肉寄生性で、宿主のウマに対してほとんど病害を示さない。終宿主はイヌである。一方、S. neurona は神経組織に寄生し、病原性が高くEPM馬原発性脊髄炎の原因となる。オポッサムが終宿主として知られる。筋肉感染のウマザルコシスティスとしての感染率は米国13％、ドイツ15％、英国62％、モロッコ46％、国内ではS. fayeri 感染率として軽種馬０％、重種馬17％が報告されている。家畜以外では様々なザルコシスティス種がエゾシカ、カモシカやその他の野生動物から国内で検出されている。

馬肉生食による食中毒と研究の現状
食中毒の原因はS. fayeri であるが、同種を含めウマのザルコシスティスがヒトへの健康被害に関連した例はこれまで報告がなく、なぜこの10年ほどで問題となったのか明らかではない。ヨーロッパのイタリア、フランスで、アジアでは韓国（済州島）、中国（大連）などで馬肉の生食は見られるが、ザルコシスティスによる食中毒の報告はない。毒性研究では動物実験や培養細胞を用いた実験よりS. fayeri に下痢原性があることが認められており、物質的には15kDaタンパク質が関与していることが示されている。このタンパク質はウシのS. cruzi に含まれ、ウサギに対する毒性が明らかな15kDaタンパク質と同様のものと考えられている。冷凍処理により毒性は消失することから、生きたザルコシストあるいはブラディゾイトの存在が下痢発症に関与しているものと推測されている。なお、嘔吐発症の原因は明らかではない。いずれにしても、現在のところ、本食中毒が感染型か毒物型なのか特定はなされていない。毒性の変化、馬の原虫感染量の変化、あるいは馬肉の流通、消費量の変化など、本食中毒問題には様々な要因が関連していることが想定される。

馬肉以外の食肉のザルコシスティス食中毒の可能性
ウシ、ブタ、ヤギ、シカなど、国内で生食可能な食肉の中にはザルコシスティス摂取の可能性があるものがあり、家畜あるいは野生動物の食肉生食（筋肉および内臓肉の刺身等）で生じた原因不明の食中毒に際してはザルコシスティスの検査を考慮すべきものと思われる。検査が必要な場合は、残品に関しては通知法に準じた方法で検査が可能である。また、ヒト感染性のS. hominis あるいはS. suihominis の感染が疑われた場合は、ホルマリン－エーテル（酢酸エチル）法を用いて糞便検査を行う。