＜非常に効率的なC型肝炎ウイルス感染培養細胞系の構築＞

・Shirasago Y, Fukazawa H, Aizaki H, Suzuki T, Suzuki T, Sugiyama K, Wakita T, Hanada K, Abe R, Fukasawa M.

 “Thermostable hepatitis C virus JFH1-derived variant isolated by adaptation to Huh7.5.1 cells.”

J. Gen. Virol. 2018: 99: 1407-1417.

doi: 10.1099/jgv.0.001117.

長い間、C型肝炎ウイルス（HCV）の培養細胞を用いた感染系は構築が難しかったのですが、劇症C型肝炎患者由来のJFH1株が脇田らにより分離されたことで、広く利用できるようになりました。このことはHCV研究において画期的なことでした。しかし、他のウイルスに比べ、必ずしもウイルス産生効率が十分高いとは言えず、感染による細胞変性効果も強いとは言えない状況でした。Huh7細胞由来のHuh7.5.1細胞は、HCV感染感受性が最も高いことが知られていましたが、我々は、さらにHCV感染感受性が高く、その性質が安定しているHuh7.5.1-8細胞を分離し（Jpn. J. Infect. Dis. 2015）、様々なHCV研究に利用してきました。今回我々は、ウイルス側についても、Huh7.5.1細胞に繰り返しJFH1株を感染させることで、Huh7.5.1細胞に適応し、効率的にウイルス産生できる変異ウイルス（JFH1-tau株）を分離することに成功しました。

Huh7.5.1-8細胞とHCV-JFH1-tau株を組み合わせることで、10¹¹コピー/ml以上のウイルス産生が見られ、恐らくこれまでで最も高いウイルス産生系が構築できたものと考えています。また、この系では、感染による細胞変性効果も明確です(細胞が最終的に全滅します)。

HCV-JFH1-tau株は、HCVコアタンパク質領域のK74T変異、HCV E2タンパク質領域のI414T変異の2カ所に変異が入っていることがわかりました。実際に、これらの2カ所の変異を人為的にJFH1株に導入すると、ウイルス産生効率が、約700倍上昇することも確認されました。それでは「なぜHCV-JFH1-tau株は感染性が非常に高いのか」について様々な検討を行った結果、HCV-JFH1株では37℃において急速に感染性が低下するのに対して、HCV-JFH1-tau株では、感染性がより安定に維持されていることがわかりました。つまり、感染性を有するウイルス粒子が多く安定的に維持されることで、ウイルス感染効率が高くなっているものと考えられました。

今回樹立したHCV-JFH1-tau株とHuh7.5.1-8細胞を用いたHCV感染系は、迅速かつ簡便にウイルス(感染)を検出できることから、HCV研究に非常に有用と考えています。

本研究は、国立感染症研究所細胞化学部･真菌部・ウイルス第二部、東京理科大学、浜松医科大学、慶應義塾大学との共同研究の成果です。研究費は、文部科学省科研費、日本医療研究開発機構（AMED）肝炎等克服実用化研究事業の支援を受けて行われました。

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＜コーヒー由来化合物であるカフェ酸、タンニン酸によるC型肝炎ウイルス感染阻害とその阻害機構の解析＞

・Shirasago Y, Inamori Y, Suzuki T, Tanida I, Suzuki T, Sugiyama K, Wakita T, Hanada K, Fukasawa M.

“Inhibition Mechanisms of Hepatitis C Virus Infection by Caffeic Acid and Tannic Acid.”

Biol. Pharm. Bull. 2019;42(5): 770-777.

 doi: 10.1248/bpb.b18-00970

疫学的な研究から、コーヒーを1日複数回摂取することで肝がんの発症リスクが低下することが知られています。C型肝炎ウイルス（HCV）感染は我が国において肝がんの主要な原因ですが、HCV感染患者における肝がん発症もコーヒーの摂取回数と逆相関することも報告されています。そこで私たちは、HCV感染に対するコーヒー成分の影響を、培養細胞HCV感染系を用いて検討することにしました。コーヒー抽出物がHCV感染を阻害すること、コーヒー抽出物の主要成分であるカフェ酸がHCV感染を阻害することがわかり、以前に報告しています（Jpn. J. Infect. Dis. 2015）。そして今回、さらに詳細に阻害メカニズムも含め解析を行いました。

様々なコーヒー含有成分をさらに検討した結果、カフェ酸に加えタンニン酸も強い阻害効果があることがわかりました。これら2つの化合物のHCV感染阻害過程を詳細に検討した結果、カフェ酸は侵入過程を強く阻害し、タンニン酸は侵入過程・複製過程・ウイルス粒子形成・分泌過程すべてを有意に阻害していることがわかりました。さらに、カフェ酸は、１）侵入過程の中でも、ウイルス粒子自体に作用すること、２）ウイルス粒子の感染性に必須のアポEタンパク質がウイルス粒子と相互作用することを阻害すること、が明らかになりました。その結果、宿主細胞表面に結合できるウイルス粒子の量が低下し、感染が強く阻害されるというわけです。

HCVに対しては、最近では非常に有効な治療薬が開発されていますが、感染細胞内で複製過程を阻害する薬物ばかりです。カフェ酸やタンニン酸のように阻害過程が異なり、食品由来成分で安価にHCV感染を防げる化合物が見つかれば、非常に有用であると考えられ、さらに検討を続けています。

本研究は、国立感染症研究所細胞化学部･ウイルス第二部、東京理科大学、浜松医科大学、慶應義塾大学との共同研究の成果です。研究費は、文部科学省科研費、日本医療研究開発機構（AMED）肝炎等克服実用化研究事業等の支援を受けて行われました。本成果は、発表雑誌のHighlighted paper selected by Editor-in-Chiefに選ばれました。

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＜コーヒー由来化合物であるカフェ酸による重症熱性血小板減少症候群ウイルス感染の阻害＞

・Ogawa M, Shirasago Y, Ando S, Shimojima M, Saijo M, Fukasawa M.

 “Caffeic acid, a coffee-related organic acid, inhibits infection by severe fever with thrombocytopenia syndrome virus in vitro.”

J. Infect. Chemother.2018; 24: 597-601.

doi: 10.1016/j.jiac.2018.03.005.

doi: 10.1016/j.jiac.2018.11.009.(Corrigendum)

重症熱性血小板減少症候群は、重症熱性血小板減少症候群ウイルス(SFTSV)を持つダニに咬まれることで主に発症し、発熱や血小板減少等が特徴であり、致死率も約30％ときわめて高く、対策が求められる感染症です。しかしながら、今のところ、認可された治療薬やワクチンはありません。

我々は、天然物化合物、特に食品由来化合物の抗ウイルス活性について興味を持ち検討をしていく中で、コーヒー抽出物がC型肝炎ウイルス(HCV)感染を阻害すること、コーヒー抽出物の主要成分であるカフェ酸がHCV感染を強く阻害することがわかり、報告してきました（Jpn. J. Infect. Dis. 2015）。HCV以外のウイルスについても検討していく中で、今回、SFTSVの培養細胞における感染が、カフェ酸で阻害されることがわかりました。

カフェ酸のSFTSV感染阻害過程を詳細に検討した結果、カフェ酸は侵入過程を強く阻害していることがわかりました。さらに、カフェ酸は、侵入過程の中でも、ウイルス粒子自体に作用し、その結果、宿主細胞表面に結合できるウイルス粒子の量が低下することで、感染が阻害されていることがわかりました。また、カフェ酸は、感染細胞から非感染細胞への感染の広がりを阻害できることもわかりました。

カフェ酸のように、食品由来成分で安価にSFTSV感染を防げる化合物が見つかれば、非常に有用であると考えられ、類縁体解析等を含め、さらに検討を続けています。

本研究は、国立感染症研究所細胞化学部･ウイルス第一部の共同研究の成果です。研究費は、文部科学省科研費、日本医療研究開発機構（AMED）等の支援を受けて行われました。本成果は、発表雑誌の“Issue Highlights”の一つに選ばれました。

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＜抗クローディン-1モノクローナル抗体はC型肝炎ウイルス感染を阻害できる＞

・Fukasawa M, Nagase S, Shirasago Y, Iida M, Yamashita M, Endo K, Yagi K, Suzuki T, Wakita T, Hanada K, Kuniyasu H, Kondoh M.

“Monoclonal antibodies against extracellular domains of claudin-1 block hepatitis C virus infection in a mouse model.”

J. Virol. 2015; 89(9):4866-79.

doi: 10.1128/JVI.03676-14.　　Free PMC Article

クローディン-1（Claudin-1）は、細胞間接着に働くタイトジャンクション（TJ）を構成する膜タンパク質であり、C型肝炎ウイルス（HCV）の侵入過程にも関与しています。我々は、ヒト肝由来Huh7.5.1細胞から分離したクローディン-1欠損変異細胞株を用いた解析により、培地からのHCV感染(セルフリー感染)だけでなく、細胞-細胞間感染においてもクローディン-1分子が必須であることを示しました。そして、クローディン-1が有望な抗HCV創薬標的の一つであると考え、クローディン-1の細胞外ドメインを特異的に認識するモノクローナル抗体の作製を試みました。クローディンの細胞外ドメインを認識する抗体の作製は非常に難しいことが知られているので、免疫は自己免疫疾患マウスに対してDNA免疫法で行い、抗体のスクリーニングはクローディン-1欠損細胞株およびHuh7.5.1細胞（親株）への抗体結合能の違いを利用する工夫をしました。その結果、インタクトのクローディン-1細胞外ドメインを認識する4種のマウスモノクローナル抗体の樹立に成功し、これら抗体は強いHCV感染阻止能を示すことが、培養細胞実験系及びヒト肝キメラマウスを用いた動物実験系の双方で確認されました。一方、培養肝細胞において、本抗体の長期処理によりクローディン-1のTJへの分布に影響は見られず、TJのintegrityにも変化が見られませんでした。また、キメラマウスでも毒性は観察されませんでした。以上の結果から、本研究で作製したクローディン-1抗体は、抗HCV侵入阻害剤開発に向けて有用なツールになることが期待されます。本研究は、国立感染症研究所細胞化学部･ウイルス第二部、大阪大学、和光純薬工業、浜松医科大学、奈良県立医科大学との共同研究の成果です。

関連する日本語総説

・深澤征義

“宿主侵入因子Claudin-1を標的とした抗C型肝炎ウイルス戦略”

ウイルス 2015; 65(2):245-254.

https://doi.org/10.2222/jsv.65.245

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